落射荧光显微镜观察方法介绍及注意事项

  利用荧光显微镜进行落射荧光观察，其操作是基于上述倒置显微镜的正确调校后，方可进行荧光装置的调校操作，以实现良好的荧光显微观察功能。同时荧光显微观察时，要注意以下方面：

（1） 合理选择荧光激发/发射滤色片组与拟使用的荧光色素或样品的荧光特性。  

（2） 在光学系统中不应放置自发荧光的样品或装置，如油镜观察时，使用香柏油会自发青色荧光。

（3） 为了有效避免因过度激发照射而产生荧光淬灭，建议在启动荧光电源5～10分后，待荧光光源趋于稳定时，再装载样品进行观察。调焦或寻找目标像的过程中，减小光阑孔径或加入磨砂玻璃片。

（4）为了延长汞灯使用寿命，电源箱不可频繁开关，正常启动15分钟后方可关闭，再次启动至少需要等待10分钟（使水银蒸汽冷却至原态），否则会影响汞灯寿命与损坏电源箱。

       下述操作介绍主要包括荧光照明器各部件，不涉及其相关原理：

一. 荧光装置的设置与调整

  荧光显微镜的重要部件是荧光激发滤色片组，每一个组件包括两种不同波段的激发滤色片，分为蓝（B）、绿(G)激发组合，紫(V)、紫外(UV)激发组合，在激发滤色片组件的内侧面贴有类型标识。在激发滤色片组件的外侧面印有型号标识，使用时，要根据所观察的样品或荧光色素合理选择，否则会影响后述操作或仪器正常荧光观察。

（1） 如果在仪器安装时未安装荧光激发滤色片组件，请取下粘在主机左侧激发滤色片插槽上的防尘胶带，将所需的激发滤色片组正确插入激发滤色片插槽内。插入过程中将会出现两次明显定位的“咔哒”声，分别表示两种激发滤色片的光学定位中心。请确认激发滤色片是否处于定位位置，否则会使其偏离光路中心而影响观察。

（2） 关闭倒置透射照明系统（关闭卤素灯照明），将主机上的电源开关拨至“0”位。如不关闭倒置透射照明系统，将会影响落射荧光观察。此时不需放置任何切片或标本在载物台上。

（3） 推开荧光挡光拉板

      荧光挡光拉板主要是用于荧光照明遮挡与衰减，以防止激发光长时间或高强度照明标本，从而使标本发生改变或破坏其组织性能。荧光挡光拉板有三个定位点，即通光孔、衰减磨砂孔、挡光位，插入过中有明显的定位。请将拉板推至通光位置。

（4） 开启荧光电源箱

     确认电源箱输入端与输出端连接可靠后，可开启电源箱开关至“-”，此时电源箱指示灯呈亮红色，散热风扇运转正常。为电流微调旋钮。

（5） 打开视场光阑

  在目视观察时，可拨动视场光阑1调节手柄，使视场光阑孔径开至最大。如在摄影摄像时，为了减少视场中杂散光晕的影响，一般将光阑适当关小至全视场的60～70％拨动视场光阑调节手柄，将视场光阑孔径开至最大。

二. 检查落射荧光光路的对中性

本仪器出厂前已校正好落射荧光光学系统的中心，但由于包装时已将汞灯取下独立包装，因此当重新安装汞灯后，可能会出现汞灯发光体中心偏离光路中心，使用前需要进行检验与校正。

（1）请准备一张白纸（约40mmX50mm），将小白纸置于载物台上。

（2）取出其中一个物镜，将转换器无物镜的安装孔位转入光路中。此时可以在白纸上呈现一个明亮的光斑，内部有呈蝴蝶结状的灯丝像。

（3）如果灯丝像不清晰，可以调节落射器集光镜调节手柄1，使灯丝像清晰。

（4）如果蝴蝶结状的灯丝像偏离明亮光斑的中心或倾斜，则需要调节汞灯的中心。可以通过调节手轮2与3调节汞灯的中心，手轮2用于左右调节，手轮3用于上下调节。

（5）重新安装物镜并转动转换器，将物镜转入光路中。现在可以利用本仪器进行荧光显微观察。

三.荧光显微观察

（1） 放置荧光显微观察标本

   本仪器配置两块或三块（选购）培养皿托板，请选合适的培养皿托板并将其放置在载物台移动尺的托板槽内，然后将标本切片或培养皿放置在托板槽内。

（2） 如果需要放置高的培养皿，可能需要将载物台移动尺拆卸下来。此时需旋松聚光镜升降装置 固紧手轮，旋转聚光镜升降装置使其摆出光路（大于90度）。用扁形“一”字螺丝刀拧松载物台下的三个螺钉，拆下载物台移动尺，将移动尺平放于工作台上。将高的培养皿直接放置在固定载物台上，为了不影响观察，请将聚光镜升降装置固紧手轮固紧。

（3） 调节粗微动手轮使标本像清晰，如果调焦后标本像不清晰或视场内像的亮度很暗，这有可能是所使用的荧光激发滤色组与荧光色素不匹配，请根据所需要观察的标本样品特性选择匹配的荧光激发滤色片组。

（4） 如果操作过程中需要暂停一段时间，但又不想关闭荧光电源箱，这种情况下需要将荧光挡光拉板推至挡光位，以保护荧光标本不受长时间激发而衰减或淬灭。